| 產(chǎn)品索引 | 5872 |
| 中文名稱： | PCR產(chǎn)物及凝膠回收試劑盒 |
| 英文名稱： | MagExtractor®-PCR & Gel Clean up- |
| 產(chǎn)品編號(hào)： | NPK - 600 |
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產(chǎn)品類別： |
分子生物學(xué) |
| 生產(chǎn)廠家： | TOYOBO |
| 產(chǎn)品價(jià)格： | 300元 |
| 產(chǎn)品規(guī)格： | 50次 |
DNA Fragment Purification Kit
MagExtractor®
-PCR & Gel Clean up-
使用說明書
(Code No. : NPK – 601)
TOYOBO CO. , LTD.Biochemical Operation Department
OSAKAJAPAN
—目錄—
[1] 前言 ........................................................................................... 1
[2] 純化流程...................................................................................... 2
[3] 試劑盒中所包含的物品................................................................. 3
[4] 試劑盒以外所需要的其他物品...................................................... 3
[5] 回收DNA溶液............................................................................. 4
[6] 回收瓊脂糖凝膠........................................................................... 5
[7] 疑難解答...................................................................................... 8
注意：
本試劑盒中所包含的都是研究用試劑。請(qǐng)不要用于診斷，臨床等場(chǎng)合。在使用本試劑盒的時(shí)候，請(qǐng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室的基本注意事項(xiàng)，注意安全。由于本試劑盒內(nèi)含有對(duì)人體有害的試劑，所以請(qǐng)務(wù)必嚴(yán)格遵守各試劑的相關(guān)使用說明書，按要求使用保護(hù)罩等防護(hù)措施。
[1] 前言
MagExtractor - PCR & Gel Clean up-利用在Chaotropic（鹽）試劑存在的情況下，核酸能吸附在硅膠上的特性1），用于手動(dòng)對(duì)DNA片段進(jìn)行純化。本試劑盒采用磁硅膠粒子，若使用磁性臺(tái)架，則能最大限度地減少?gòu)?fù)雜的離心操作，能夠快速地的純化DNA片段。
1)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2) 615-619(1979)
特征
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·從DNA溶液（約100μl），以及TAE·TBE瓊脂糖凝膠（約0.3g）中， 能夠以平均回收率60～70％比例回收DNA片段（約100bp～50kbp）。 ·能夠在5分鐘之內(nèi)從DNA溶液中，或者在15分鐘之內(nèi)從瓊脂糖凝膠 中回收DNA片段。 ·由于在室溫下瓊脂糖凝膠可以被融解，因此無需進(jìn)行加熱反應(yīng)。
* 要徹底去除混雜在回收液中的乙醇時(shí)則需要進(jìn)行加熱處理（55℃）。 |
試劑盒的用途
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·脫鹽，去除dNTPs。 ·去除引物。 ·去除酶（堿性磷酸酶等）。 ·從電泳后的瓊脂糖凝膠塊中回收DNA。 |
回收的DNA的用途
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·RI.Non-RI測(cè)序反應(yīng) ·限制酶反應(yīng) ·標(biāo)記反應(yīng) ·雜交反應(yīng) ·連接反應(yīng) ·轉(zhuǎn)化反應(yīng) ·擴(kuò)增反應(yīng) |
[2] 純化流程
下圖顯示為使用MagExtractor-PCR &
Gel Clean up-時(shí)的純化流程。
純化DNA片段 Elute
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75％乙醇
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洗凈液
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溶出液
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磁石 磁性或離心分離
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磁珠
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Wash
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Bind
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Melt
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凝膠塊
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吸附液
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電泳后的凝膠
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[3] 試劑盒中所包含的物品
本試劑盒中包含以下試劑。（200次份）
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試劑量 |
保存條件 |
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吸附液* |
88ml |
避光室溫保存 |
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洗凈液* |
132ml |
室溫保存 |
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磁珠 |
7ml |
室溫保存 |
*吸附液，洗凈液在低溫情況下會(huì)析出結(jié)晶。請(qǐng)一邊用手捂暖，一邊
將其倒轉(zhuǎn)混合讓結(jié)晶溶解后使用。另外，吸附液及洗凈液內(nèi)含有蛋白
變性劑。在使用時(shí)務(wù)必注意，萬一沾到身體，請(qǐng)立刻用清水沖洗。
[4] 試劑盒以外所需要的其他物品
1．試劑
·滅菌蒸餾水<溶出液>
·75％乙醇<洗凈用>
2．器具，器材
·1.5ml小型試管用磁性臺(tái)架
·簡(jiǎn)易臺(tái)式離心機(jī)
·漩渦混合器
·Heat Block 55℃（用于在需要去除混于回收液中的乙醇的場(chǎng)合）
*可使用本公司的磁性臺(tái)架Magical Trapper（Code No.：MGS-101）等產(chǎn)品。
[5] 回收DNA溶液
1．前言
·本操作程序用于從DNA溶液（約100μl）中回收DNA片段。
·能夠回收的DNA大小約為100bp～50kb。另外，40bp以下的核酸
幾乎能夠被加以除去。
· 磁珠的最大吸附量為每30μl磁珠大約吸附5μg。使用時(shí)請(qǐng)以2.5μg左右為參考量。
·能夠從PCR反應(yīng)液，限制酶反應(yīng)溶液，堿性磷酸酶反應(yīng)液等各種反
應(yīng)液中回收DNA。
·回收后的DNA，能夠用于限制酶處理、測(cè)序、連接、標(biāo)記、雜交等多種反應(yīng)
2．操作程序
DNA溶液（100μl）1）
↓← 400μl吸附液
↓← 30μl磁珠2)
↓不時(shí)用漩渦混合器攪拌，并放置約1～2min（室溫）
B/F（固/液）分離3）
↓←（600μl洗凈液）4）
↓漩渦混合器攪拌10sec，
B/F分離。3）
↓←1ml75％乙醇4）
↓漩渦混合器攪拌10sec，
B/F分離。3）
瞬時(shí)高速離心，徹底去除上清部分。
（打開小型試管的蓋子，55℃下放置5min，干燥）4）
↓←25～100μl蒸餾水
↓漩渦混合器攪拌10sec，
（在無法充分將粒子分離的情況下，請(qǐng)用pipetting來分離粒子。）
↓放置2min
B/F分離，回收上清液。5）
1）請(qǐng)盡量不要含礦物油。
2）使用磁珠前，請(qǐng)徹底懸濁混合后再使用。
3）將試管放置在磁性臺(tái)架上，把磁珠挪近磁石，用微量移液器持續(xù)去除
上清部分。通過乙醇清洗時(shí)，可以通過將上清液倒入其他容器進(jìn)行去除。
B/F分離時(shí)推薦使用對(duì)應(yīng)于微型試管的磁性臺(tái)架，但也可用簡(jiǎn)易臺(tái)式離心機(jī)，用大約6,000r.p.m程度，5sec.的離心進(jìn)行分離。g會(huì)根據(jù)離心機(jī)的轉(zhuǎn)子口徑而發(fā)生變化，所以請(qǐng)調(diào)整旋轉(zhuǎn)數(shù)，使得能更有效地集合粒子，并保證凝結(jié)不至于過度。
4）請(qǐng)參照3.的表。
5）回收液中少量混入的磁珠并不會(huì)有礙下一次的反應(yīng)，但在測(cè)定吸附度
等場(chǎng)合時(shí)，請(qǐng)通過瞬時(shí)高速離心除去磁珠。
3．關(guān)于工序的省略，純化規(guī)模
·洗凈工序，加熱工序可以省略（請(qǐng)參照下表）
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用途 |
洗凈 |
干燥 |
備注 |
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洗凈液 |
75％乙醇溶液 |
|||
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測(cè)序，限制酶反應(yīng)，連接反應(yīng)等的前處理 |
－ |
1次 |
－ |
標(biāo)準(zhǔn)操作程序?；厥盏暮怂崮苡糜?/span>Low Buffer系列的限制酶切斷。 |
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鹽的混入會(huì)產(chǎn)生影響的場(chǎng)合 |
－ |
2次 |
－ |
吸附液和洗凈液含有高濃度的鹽分。 |
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乙醇的混入會(huì)產(chǎn)生影響的場(chǎng)合 |
－ |
1次（2次） |
55℃，5min |
用于易受乙醇影響的前處理。 |
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要去除混入的酶的場(chǎng)合 |
1次 |
1次（2次） |
－ |
用于去除堿性磷酸酶等。 |
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要通過吸光度來準(zhǔn)確定量核酸濃度的場(chǎng)合 |
1次 |
2次 |
－ |
吸附液內(nèi)含有能吸收紫外線的物質(zhì)。 |
·根據(jù)DNA溶液的量，可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
液和磁珠的使用量。此時(shí)，無需減少75％乙醇溶液的使用量。
[6] 回收瓊脂糖凝膠
1．前言
·本操作程序適用于從TAE或者TBE瓊脂糖凝膠（約0.3g）中回收
DNA片段。本操作程序是以瓊脂糖濃度2％以下的凝膠為對(duì)象。
要使用2％以上的凝膠時(shí)，推薦所使用凝膠的量少于0.3g。另外，本
操作程序不需要使用特殊的低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠。
·能夠回收的DNA大小約為100bp～50kbp。
·回收后的DNA主要用于連接反應(yīng)、標(biāo)記、測(cè)序等反應(yīng)。
2．操作程序
瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色。
↓
在UV照射下（Long wave），為了使得目標(biāo)條帶盡可能地變小，使
用切割刀或手術(shù)刀等進(jìn)行切開。
↓
把切開的瓊脂糖切細(xì)，放到1.5ml小型試管中。（此時(shí)稱得重量，如
果大于0.3g則分幾次進(jìn)行。）1）
↓←400μl吸附液
在凝膠完全溶解之前，將其放置在室溫中，并不時(shí)進(jìn)行攪拌。2）
↓←30μl磁珠3）
↓經(jīng)常用漩渦混合器攪拌，并放置2min（室溫），
B/F分離。4）
↓←600μl洗凈液
↓漩渦混合器攪拌10sec，
B/F分離。4）
↓←1ml75％乙醇溶液5）
↓漩渦混合器攪拌10sec，
B/F分離。4）
瞬時(shí)高速離心，徹底去除上清部分。
（打開微型試管的蓋子，55℃下放置5min，干燥）5）
↓←25～100μl蒸餾水
↓漩渦混合器攪拌10sec
（在無法充分分開粒子的情況下，請(qǐng)用pipetting來分散粒子。）
↓放置2min
B/F分離，回收上清液6）
1） 將瓊脂糖凝膠制成切片，以利于溶解。
2） 如果想要快速溶解瓊脂糖凝膠或凝膠難以溶解時(shí)，請(qǐng)加溫至55℃
5min。
3） 使用磁珠前，請(qǐng)徹底混合后再使用。
4） 將試管放置在磁性臺(tái)架上，把磁珠挪近磁石，用微量移液器持續(xù)去
除上清部分。要洗凈乙醇，也可以通過將上清液倒入其他容器來去除。
B/F分離時(shí)推薦使用對(duì)應(yīng)于微型試管的磁性臺(tái)架，但也可使用簡(jiǎn)易臺(tái)式離心機(jī)，用大約6,000r.p.m程度，5sec.的離心進(jìn)行分離。g會(huì)根據(jù)離心機(jī)的轉(zhuǎn)子口徑而發(fā)生變化，故請(qǐng)調(diào)整旋轉(zhuǎn)數(shù)，使得更有效地集合粒子，并保證凝結(jié)不至于過度。
5） 請(qǐng)參照3.的表。
6） 回收液中混入少量磁珠并不會(huì)有礙下一次的反應(yīng)，但在測(cè)定吸附
度等場(chǎng)合時(shí)，請(qǐng)通過瞬時(shí)高速離心除去磁珠。
3．關(guān)于工序的省略，純化規(guī)模
·洗凈工序，加熱工序可以省略（請(qǐng)參照下表）
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用途 |
洗凈 |
干燥 |
備注 |
|
|
洗凈液* |
75％乙醇溶液 |
|||
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連接反應(yīng), 測(cè)序等 |
1次 |
1次 |
－ |
標(biāo)準(zhǔn)操作程序。 |
|
鹽的混入會(huì)產(chǎn)生影響的場(chǎng)合 |
1次 |
2次 |
－ |
吸附液和洗凈液中含有高濃度的鹽分。 |
|
乙醇的混入會(huì)產(chǎn)生影響的場(chǎng)合 |
1次 |
1次（2次） |
55℃，5min |
用于容易受乙醇影響的前處理。 |
|
要通過吸光度來準(zhǔn)確定量核酸濃度的場(chǎng)合 |
1次 |
2次 |
－ |
吸附液內(nèi)含有吸收紫外線的物質(zhì)。 |
*從瓊脂糖凝膠中回收核酸時(shí)，必須用洗凈液清洗。
·根據(jù)DNA溶液的量，可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
液和磁珠的使用量。此時(shí)，無需減少75％乙醇溶液的使用量。
[7] 疑難解答
1．回收量低
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原因 |
對(duì)策 |
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去除乙醇不徹底 |
瞬時(shí)高速離心后，請(qǐng)仔細(xì)去除75％乙醇溶液。 |
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溶出不充分 |
通過10mM Tris-HCI（pH8.0），或者TE buffer能夠提高溶出的效率。另外，如果加溫至55℃保持2min能夠更加有效地提高溶出效率。 |
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吸附時(shí)間不合適 |
如果吸附過剩，回收量則會(huì)變少。最恰當(dāng)?shù)奈綍r(shí)間是，對(duì)于DNA溶液為1～2min，對(duì)于凝膠則為2min。 |
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溶出時(shí)的攪拌不充分 |
溶出時(shí)，如果磁珠的混合不充分，回收量會(huì)減少。在瞬時(shí)高速離心后，磁珠會(huì)在底部結(jié)塊，請(qǐng)仔細(xì)將其散開。特別是在從瓊脂糖凝膠中進(jìn)行純化的時(shí)候，結(jié)塊的磁珠會(huì)比較難以重新散開。 |
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瓊脂糖凝膠的量大于0.3g |
請(qǐng)減少瓊脂糖凝膠的量。 |
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使用2％以上的瓊脂糖 |
請(qǐng)減少瓊脂糖凝膠的量。 |
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沒有用洗凈液清洗 |
從瓊脂糖凝膠中回收DNA時(shí)，請(qǐng)務(wù)必先用洗凈液清洗。 |
2．回收的核酸的吸光度不準(zhǔn)確
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原因 |
對(duì)策 |
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清洗不充分 |
吸附液中含有吸收紫外線的物質(zhì)。要對(duì)回收的核酸定量，請(qǐng)用洗凈液以及75％乙醇溶液來清洗。 |
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混入了吸附液 |
吸附液中含有吸收紫外線的物質(zhì)。請(qǐng)仔細(xì)去除吸附液。用面紙等擦拭試管的蓋子上沾有的吸附液，可以有效改善狀況。 |
3．回收后的核酸不能良好地進(jìn)行反應(yīng)
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原因 |
對(duì)策 |
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鹽阻礙了反應(yīng) |
請(qǐng)?zhí)砑觾纱?/span>75％乙醇溶液進(jìn)行清洗的工序。吸附液和洗凈液都含有高濃度的鹽分。 |
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乙醇阻礙了反應(yīng) |
請(qǐng)按照操作程序，對(duì)乙醇進(jìn)行干燥處理。 |
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酶未能完全去除 |
要去除反應(yīng)液中的堿性磷酸酶等酶，請(qǐng)用洗凈液以及75％乙醇溶液進(jìn)行清洗。 |
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反應(yīng)用的酵素過少 |
從瓊脂糖凝膠中回收核酸時(shí)，反應(yīng)用的酶量應(yīng)比通常要多，這樣就能得到準(zhǔn)確良好的結(jié)果。 |
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使用的瓊脂糖級(jí)別不夠 |
請(qǐng)使用高級(jí)別的瓊脂糖。 |
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從瓊脂糖凝膠中分離條帶時(shí)，受到的紫外線照射過多 |
請(qǐng)用Long wave（365nm附近）的紫外線來進(jìn)行切片工作。 |