反相離子對色譜分離水溶性維生素

1.掌握反相離子對色譜分離水溶性纖維素的方法。

2.了解反相離子對色譜分離水溶性纖維素的原理及方法特點(diǎn)。

水溶性纖維素包括：V_B1 (硫胺素)，V_B2(核黃素)，V_B5(煙酰胺，煙酸)，V_B6(吡哆醛、吡哆醇)，V_B11（葉酸），V_B12(鈷

維生素)和V_C等。在用反相離子對色譜法測定中，陽離子A⁺(樣品離子)和反離子B^-(烷基磺酸根離子)先形成離于對，再在

流動相和固定相中分配，

保留時(shí)間為：

t_R=t_M (1+ E_A，B[B-]_水相/β)

式中，β為相比，t_M為死時(shí)間，E_A，B為平衡常數(shù)。

可見樣品的保留時(shí)間受離子對試劑的濃度和可逆過程的總平衡常數(shù)的影響。因此，對混合水溶性纖維素分離的影響，

除反離子的濃度外，還有流動相的pH值，甲醇與水的配比，有機(jī)添加劑三乙胺(TEA)濃度和柱溫。TEA作為流動相的添加

劑，可減少堿性樣品色譜峰的拖尾。

1．儀器高效液相色譜儀；超聲波發(fā)生器。

2．試劑：

甲醇；十二烷基磺酸鈉；三乙胺；水溶性纖維素混合標(biāo)樣。

混合標(biāo)樣配制方法：

將V_B1、煙酸、煙酰胺、吡哆醛、吡哆醇、V_B12和V_C溶于水配成含量均為30μg／m1的水溶液(溶液1)。將V_B2和V_B11滴入少

量發(fā)5％Na0H使之溶解，再用去離子水稀釋至各含100μg／m1的混合液(溶液2)。使用前，將溶液l和溶液2以1：1混合

，配成含9種纖維素的混合標(biāo)樣。以相應(yīng)的方法制成各維生素的單個(gè)標(biāo)樣。

1．實(shí)驗(yàn)條件：

　　1) 色譜柱：YWG—G₁₈，10μm，25cm×φ4.6mm；

　　2) 流動相：甲醇：水=40：60，十二烷基磺酸鈉1.5mmol/l，三乙胺0.3％，用磷酸調(diào)節(jié)PH至3.0；　

　　3) 檢測器：UV—254nm；

　　4) 流動相流速：1.0mI／mln；

　　5) 校溫：30℃。

　　2．啟動儀器，用大約180m1流動相流經(jīng)色譜拄，待基線穩(wěn)定后，分別注入10μl的各單個(gè)維生素標(biāo)樣，記錄色譜圖

和出峰時(shí)間。

3．注入10μll混合試樣，記錄色譜圖和各峰的出峰時(shí)間。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用90％甲醇一水溶液沖洗色譜拄1h左右。

１.試述反相離子對色譜的分離機(jī)理。

２.反相離子對色譜同時(shí)分離混合水溶性纖維素有哪些影響因素？

1.制備流動相用試劑均為分析純，水用二次蒸餾水，維生素為生物試劑。

2.用庚烷鹽作為離子對試劑效果更優(yōu)，但其價(jià)格較貴。