一、概要
用來檢測(cè)呋喃唑酮代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù)，采用AOZ衍生物的特異性抗體，具有很高的準(zhǔn)確度和靈敏度，較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)樣本量大等特點(diǎn)在檢測(cè)中很好的表現(xiàn)出來。（本試劑盒的檢測(cè)時(shí)間為1.5小時(shí)。）
二、試驗(yàn)原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留的AOZ經(jīng)衍生化后和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃唑酮代謝物的衍生物抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物AOZ的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中呋喃唑酮代謝物的殘留量。
三、適用范圍
可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織（雞、豬、牛等）、牛奶、蜂蜜和雞蛋樣本中的呋喃唑酮代謝物的殘留量。
四、交叉反應(yīng)率
呋喃唑酮代謝物…………………………………… 100%
呋喃它酮代謝物…………………………………小于 0.1%
呋喃妥因代謝物…………………………………小于 0.1%
硝基糠腙（呋喃西林）代謝物…………………小于0.1%
呋喃唑酮…………………………………………………16.3%
呋喃它酮………………………………………………小于1%
呋喃妥因………………………………………………小于1%
硝基糠腙（呋喃西林）………………………………小于1%
五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑
設(shè)備：
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置
┅┅均質(zhì)器
┅┅振蕩器
┅┅渦旋儀
┅┅離心機(jī)
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶： 100ml、1L
┅┅玻璃試管：10ml
┅┅聚苯乙烯離心管：2ml、10ml、50ml
┅┅微量移液器：?jiǎn)蔚?20ml～200ml、100ml～1000ml
多道 250ml
試劑：
┅┅乙酸乙酯（分析純）
┅┅正己烷（或正庚烷）（分析純）
┅┅三水合磷酸氫二鉀（分析純）
┅┅濃鹽酸
┅┅氫氧化鈉（分析純）
┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）（分析純）（供奶、雞蛋樣用）
┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7 H2O) (分析純)（供奶、雞蛋樣用）
┅┅去離子水
六、提供的材料與試劑
1、96孔酶標(biāo)板×1塊（包被有偶聯(lián)抗原）
2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb,0.05ppb,0.15ppb,0.45ppb,1.35ppb,4.05ppb 3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：（1ml/瓶） 100ppb
4、酶標(biāo)二抗?jié)饪s液 1.5ml …………………… 紅色帽
5、抗體濃縮液 0.8ml……………………綠色帽
6、底物液 A 液 7ml …………………… 白色帽
7、底物液 B 液 7ml …………………… 紅色帽
8、終 止 液 7ml …………………… 黃色帽
9、20×濃縮洗滌液 40ml………………………透明帽
10、2×濃縮復(fù)溶液 50ml……………………藍(lán)色帽
11、2-硝基苯甲醛 15.1mg……………………黑色帽
七、溶液的配制
配液1: 衍生化試劑
向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10ml（濃度為10mM）。
配液2: 0.1M磷酸氫二鉀溶液
稱取22.8g三水合磷酸氫二鉀加去離子水溶解定容至1L。
配液3: C液（供奶樣、雞蛋用）：
0.36M亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液
稱取10.7g 亞硝基鐵氰化鈉加去離子水溶解定容至100ml
D液（供奶樣、雞蛋用）：
1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）溶液
稱取28.8g 硫酸鋅用去離子水溶解定容至100ml
配液4: 1M鹽酸溶液
量取8.3ml濃鹽酸加入到盛有去離子水的容器中定容至100ml。
配液5: 1M 氫氧化鈉溶液
稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。
配液6: 復(fù)溶工作液
用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1：1體積比進(jìn)行稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于抗體濃縮液、酶標(biāo)二抗?jié)饪s液的稀釋及提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
配液7: 洗滌液工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
八、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時(shí)，都必須注意：
（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否潔凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（c）衍生化試劑可于2-8℃保存半年。
（d）磷酸氫二鉀溶液可于2-8℃保存三個(gè)月
（e）鹽酸溶液可于室溫保存三個(gè)月
（f）氫氧化鈉溶液可于室溫保存三個(gè)月
（g）未處理的樣本冷凍保存。
（h）處理好的樣本可在2-8℃避光保存24小時(shí)。
（i）雞蛋樣本前處理過程中，50℃水浴2小時(shí)，中間每半小時(shí)必須用振蕩器劇烈振蕩1-2分鐘，它直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
（一）肌肉、肝臟組織前處理方法
┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；
┅┅接(四)的描述方法。
注：樣本應(yīng)當(dāng)在陰涼避光處冷藏保存
（二）牛奶前處理方法
┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；
┅┅取5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml聚苯乙烯離心管中；
┅┅分別加入250ml C液和250ml D液（見配液3）；
┅┅用振蕩器充分振蕩混合，3000g以上，4~12 oC（39-54℉）離心10min。如果沒有恒溫離心機(jī)，則先將樣本降溫至大約8 oC（46℉），然后離心；
┅┅接(四)的描述方法
（三）蜂蜜前處理方法
┅┅稱取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；
┅┅用4ml去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；
┅┅加入0.5ml 1M鹽酸溶液（見配液4）和100ml衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩；
┅┅接(四)第二步描述方法（標(biāo) * 處）。
（四）接上面的方法
┅┅稱取1.0±0.05g均質(zhì)后的組織樣本（肝樣/肉樣）、制備好的牛奶樣本上清液1.1ml（相當(dāng)于1ml的奶樣），分別加入4ml的去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）和100ml衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩2min；
*┅┅在37 oC過夜孵育（大約16h）；
┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液（見配液2）、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液（見配液5）和5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；
┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中，于50～60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?/p>
┅┅加入1ml正己烷（或正庚烷），用渦旋儀渦動(dòng)30s，再加入1ml復(fù)溶工作液（見配液6），用渦旋儀渦動(dòng)1min充分混勻；
┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅除去上層有機(jī)相，取下層水相50µl用于分析。
（五）雞蛋前處理方法
┅┅用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本(蛋黃或全蛋)；
┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的蛋樣本至10ml聚苯乙烯離心管中，分別加入4ml去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）、200µl C液（見配液3），用振蕩器振蕩1min混勻；
┅┅加入200µl D液（見配液3），用振蕩器充分振蕩5min，3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅取全部上清液至15ml聚苯乙烯離心管中，加入200µl衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩，50℃水浴2h（中間每半小時(shí)用振蕩器劇烈振蕩1-2分鐘）；
┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液（見配液2）、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液（見配液5）5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s，3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅取2.5ml上層有機(jī)相，于50～60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?/p>
┅┅加入1ml正己烷（或正庚烷），用渦旋儀渦動(dòng)30s，再加入2ml復(fù)溶工作液（見配液6），用渦旋儀渦動(dòng)1min充分混勻；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，請(qǐng)于60℃水浴中加熱5min，再重復(fù)離心）；
┅┅除去上層有機(jī)相，取下層水相50µl用于分析。
九、檢測(cè)步驟
測(cè)定前應(yīng)須知：
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、抗體工作液的稀釋：將抗體濃縮液用復(fù)溶工作液按照1：10體積比進(jìn)行稀釋（1份抗體濃縮液加入10份復(fù)溶工作液）。
6、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50ml到對(duì)應(yīng)的微孔中，然后加入抗體工作液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
7、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見配液7）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
8、酶標(biāo)二抗工作液的稀釋：將酶標(biāo)二抗?jié)饪s液用復(fù)溶工作液按照1：10體積比進(jìn)行稀釋（1份酶標(biāo)二抗?jié)饪s液加入10份復(fù)溶工作液）。
9、加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟7。
10、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min（見注意事項(xiàng)8）。
11、測(cè)定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。
十、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與呋喃唑酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān)。
1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310，樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.104；0.05ppb為1.224；0.15ppb為0.859；0.45ppb為0.522； 1.35ppb為0.270；4.05ppb為0.129。則樣本1的濃度范圍是0.45ppb-1.35ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.15ppb-0.45ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
|
百分吸光度值（%）＝ |
B |
×100% |
|
B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）
樣本稀釋倍數(shù)
肌肉、肝臟組織樣品稀釋倍數(shù)：2
奶樣樣品稀釋倍數(shù)：2
蜂蜜樣品的稀釋倍數(shù)：2
雞蛋樣品的稀釋倍數(shù)：2
十一、檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
試劑盒靈敏度：0.05ppb
樣本最低檢測(cè)限：
組織、蜂蜜 ……………………………………………0.1ppb
雞蛋、奶樣………………………………………………0.1ppb
準(zhǔn)確度：
肌肉、肝臟組織 ……………………………… 75±15%
蜂蜜 …………………………………………… 90±15%
雞蛋 …………………………………………… 90±20%
奶樣………………………………………………… 90±10%
精密度：
試劑盒的變異系數(shù)均小于10%
十二、注意事項(xiàng)
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
6、儲(chǔ)存條件
保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質(zhì)的跡象
發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20min（或更長(zhǎng)），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。
9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
十三、貯藏條件及保存期
貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月.北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司
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