一、概要

本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測(cè)產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，操作時(shí)間僅需1.5小時(shí)，能最大限度地減少工作強(qiáng)度和操作誤差。

二、試驗(yàn)原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗三者的抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中磺胺類藥物的殘留量。

三、適用范圍

可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織（肌肉/肝臟/魚/蝦）、雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清等樣品中磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）藥物的殘留量。

四、交叉反應(yīng)率

磺胺嘧啶（SD或SDZ）……………………………  100.0%

磺胺間甲氧嘧啶/磺胺六甲氧嘧啶（SMM）…… 98%

磺胺甲噁唑（SMZ）…………………………………  120.0%

磺胺噻唑（ST）………………………………………  98.0%

酞?；青邕颍≒ST）…………………………………  62.8%

磺胺甲噻二唑……………………………………  103%

磺胺吡啶……………………………………………  51.9%

磺胺對(duì)甲氧嘧啶…………………………… 35%

五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

設(shè)備：

┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm

┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置

┅┅均質(zhì)器振蕩器、洗耳球、容量瓶：500ml

┅┅渦旋儀、離心機(jī)

┅┅天平：感量0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅玻璃試管：15ml

┅┅聚苯乙烯離心管：50ml

┅┅玻璃離心管：10ml

┅┅微量移液器：?jiǎn)蔚?20ml～200ml、200ml～1000ml

多道 250ml

試劑：

----乙腈(分析純)（動(dòng)物組織專用）

----乙酸乙酯(分析純)

----正己烷(分析純)

----十二水合磷酸氫二鈉(分析純)

----二水合磷酸二氫鈉(分析純)

----氫氧化鈉(分析純)

----濃鹽酸

----去離子水

六、提供的材料與試劑

1、96孔酶標(biāo)板×1塊（包被有偶聯(lián)抗原）

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）

0ppb，2ppb，4ppb，8ppb，16ppb，32ppb

3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：（1ml/瓶） 1ppm

4、酶標(biāo)二抗         12ml …………………… 紅色帽

5、抗體工作液       10ml …………………… 綠色帽

6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽

7、底物液 B 液       7ml …………………… 紅色帽

8、終 止 液          7ml …………………… 黃色帽

9、20×濃縮洗滌液     40ml……………………… 透明帽

10、20×濃縮提取液    50ml……………………… 藍(lán)色帽

七、溶液的配制

 配液1: 0.02M磷酸鹽緩沖液

        稱取5.36g十二水合磷酸氫二鈉、0.2g二水合磷酸二氫鉀、8g氯化鈉和0.2g氯化鉀加去離子水溶解定容至1L

配液2: 0.5 M鹽酸溶液

          量取41.7ml濃鹽酸加去離子水定容至500ml

配液3: 0.2 M 氫氧化鈉        

           稱取4g氫氧化鈉加去離子水定容至500ml

配液4: 提取工作液

           用去離子水將20×濃縮提取液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮提取液+19份去離子水）用于樣本的提取，提取工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

配液5: 洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（或按需量稀釋）（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

八、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

   （b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

   （c）所有樣本復(fù)溶后均不能保存

(一) 高檢測(cè)限樣本

（a ）動(dòng)物組織（雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、雞蛋）

┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；

┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩20min，3000g以上離心5min；

┅┅取上清液2ml至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/p>

┅┅加入1ml正己烷用渦旋儀渦動(dòng)20s溶解干燥殘留物，加入1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見配液1），用渦旋儀渦動(dòng)1min，3000g以上離心10min；

┅┅除去上層正己烷相，取下層水相20ml用于分析。

（b）動(dòng)物組織（魚、蝦）

┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；

┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入2ml去離子水，用渦旋儀渦動(dòng)至糊狀，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩20min，3000g以上離心5min；

┅┅取上清液2.5ml至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/p>

┅┅加1ml正己烷用渦旋儀渦動(dòng)20s溶解干燥殘留物，加入1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見配液1），用渦旋儀渦動(dòng)1min，3000g以上離心10min；

┅┅除去上層正己烷相，取下層水相20ml用于分析。

（二）低檢測(cè)限樣本提取方法

動(dòng)物組織（雞肉、雞肝、豬肉、豬肝）

┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；

┅┅稱取2.0g±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入 10ml提取工作液，充分上下混合振蕩10min，再放入37℃恒溫箱，30min后取出，3000g以上，10℃離心10min；

┅┅取清亮上清20ml用于分析。

（三）血清前處理方法

┅┅將血樣本于室溫放置30min，3000g以上，10℃離心10min，分離出血清或過濾血清；

┅┅取1ml血清至10ml干凈的玻璃試管中，加入3ml 0.02 M 磷酸鹽緩沖液（見配液1）混合均勻；

┅┅取20ml用于分析。

（四）蜂蜜前處理方法

┅┅稱取1±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；

┅┅加入2ml 0.5 M鹽酸溶液（見配液2），用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；

┅┅放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30min；

┅┅加入5ml 0.2M氫氧化鈉（見配液3）（調(diào)pH值范圍為4～6）用振蕩器振蕩1min，再加入8ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩5min，3000g以上離心10min；

┅┅取上層液體至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/p>

┅┅加1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見配液1）溶解；

┅┅取20ml用于分析

（五）尿液前處理方法

┅┅將尿液于3000g以上，室溫（20-25℃）離心5min，直至尿液樣本清亮；

┅┅移取1ml清亮尿液至10ml干凈的玻璃試管中，加入3ml提取工作液混合；

┅┅取20ml用于分析。

 （六）牛奶前處理方法

┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；

┅┅移取1ml離心后的牛奶樣本至10ml干凈的玻璃試管中，加入0.02 M 磷酸鹽緩沖液（見配液1）按1︰19的體積比進(jìn)行稀釋（即20ml牛奶+380ml 0.02磷酸鹽緩沖液）；

┅┅取20ml用于分析。

九、檢測(cè)步驟

測(cè)定前應(yīng)須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗滌工作液在使用前也需回溫。

4、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml到對(duì)應(yīng)的微孔中，然后加抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。

6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見配液5）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

7、加酶標(biāo)二抗：加酶標(biāo)二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)20min，取出重復(fù)步驟6。

8、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min（見注意事項(xiàng)8）。

9、測(cè)定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。

十、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān)。

1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.211，樣本2的吸光度值為0.785，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.100；2ppb為1.680；4ppb為1.210；8ppb為0.580；16ppb為0.308；32ppb為0.120。則樣本1的濃度范圍是16ppb-32ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類藥物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是4ppb-8ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類藥物殘留的濃度范圍。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	B	×100%
	B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物的實(shí)際濃度

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/p>

樣本稀釋倍數(shù)

組織樣品稀釋倍數(shù)

高檢測(cè)限樣本：

（a）方法處理肌肉/肝臟和雞蛋樣品稀釋倍數(shù)：2

（b）方法處理魚、蝦樣品稀釋倍數(shù)：2

低檢測(cè)限樣本

肌肉/肝臟： 5

血清樣品稀釋倍數(shù)：4

蜂蜜樣品稀釋倍數(shù)：1

尿樣樣品稀釋倍數(shù)：4

奶樣樣品稀釋倍數(shù)：20

十一、檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

試劑盒靈敏度：2ppb

樣本最低檢測(cè)限：

血清樣本/尿樣檢測(cè)下限…………………………………8ppb

牛奶樣本檢測(cè)下限………………………………………40ppb

組織樣本檢測(cè)下限

高檢測(cè)限

肌肉/肝臟和雞蛋……………………………………… 4ppb

魚、蝦…………………………………………………… 4ppb

低檢測(cè)限

肌肉/肝臟………………………………………………10ppb

準(zhǔn)確度：

雞肉/肝、豬肉/肝……………………………………75±10%

雞蛋…………………………………………………69±10%

蜂蜜、牛奶、血清……………………………………70±10%

精密度：

試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項(xiàng)

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、每加一種試劑前需要將其搖勻。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

6、儲(chǔ)存條件

保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、在加入底物液A和底物液B液后，一般顯色20min即可。若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到25min（或更長(zhǎng)），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。

9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十三、貯藏條件及保存期

     貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。

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