一、概要
本試劑盒是應用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡便、準確和靈敏度高等特點，操作時間僅需1.5小時，能最大限度地減少工作強度和操作誤差。
二、試驗原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑與微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗三者的抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含磺胺類藥物的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中磺胺類藥物的殘留量。
三、適用范圍
可定性、定量檢測動物組織（肌肉/肝臟/魚/蝦）、雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清等樣品中磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）藥物的殘留量。
四、交叉反應率
磺胺嘧啶（SD或SDZ）…………………………… 100.0%
磺胺間甲氧嘧啶/磺胺六甲氧嘧啶（SMM）…… 98%
磺胺甲噁唑（SMZ）………………………………… 120.0%
磺胺噻唑（ST）……………………………………… 98.0%
酞酰磺噻唑（PST）………………………………… 62.8%
磺胺甲噻二唑…………………………………… 103%
磺胺吡啶…………………………………………… 51.9%
磺胺對甲氧嘧啶…………………………… 35%
五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑
設(shè)備：
┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm
┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置
┅┅均質(zhì)器振蕩器、洗耳球、容量瓶：500ml
┅┅渦旋儀、離心機
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅玻璃試管：15ml
┅┅聚苯乙烯離心管：50ml
┅┅玻璃離心管：10ml
┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、200ml～1000ml
多道 250ml
試劑：
----乙腈(分析純)（動物組織專用）
----乙酸乙酯(分析純)
----正己烷(分析純)
----十二水合磷酸氫二鈉(分析純)
----二水合磷酸二氫鈉(分析純)
----氫氧化鈉(分析純)
----濃鹽酸
----去離子水
六、提供的材料與試劑
1、96孔酶標板×1塊（包被有偶聯(lián)抗原）
2、標準液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb，2ppb，4ppb，8ppb，16ppb，32ppb
3、高濃度標準品：（1ml/瓶） 1ppm
4、酶標二抗 12ml …………………… 紅色帽
5、抗體工作液 10ml …………………… 綠色帽
6、底物液 A 液 7ml …………………… 白色帽
7、底物液 B 液 7ml …………………… 紅色帽
8、終 止 液 7ml …………………… 黃色帽
9、20×濃縮洗滌液 40ml……………………… 透明帽
10、20×濃縮提取液 50ml……………………… 藍色帽
七、溶液的配制
配液1: 0.02M磷酸鹽緩沖液
稱取5.36g十二水合磷酸氫二鈉、0.2g二水合磷酸二氫鉀、8g氯化鈉和0.2g氯化鉀加去離子水溶解定容至1L
配液2: 0.5 M鹽酸溶液
量取41.7ml濃鹽酸加去離子水定容至500ml
配液3: 0.2 M 氫氧化鈉
稱取4g氫氧化鈉加去離子水定容至500ml
配液4: 提取工作液
用去離子水將20×濃縮提取液按1：19體積比進行稀釋（1份20×濃縮提取液+19份去離子水）用于樣本的提取，提取工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。
配液5: 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋（或按需量稀釋）（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。
八、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結(jié)果
（c）所有樣本復溶后均不能保存
(一) 高檢測限樣本
（a ）動物組織（雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、雞蛋）
┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩20min，3000g以上離心5min；
┅┅取上清液2ml至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；
┅┅加入1ml正己烷用渦旋儀渦動20s溶解干燥殘留物，加入1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見配液1），用渦旋儀渦動1min，3000g以上離心10min；
┅┅除去上層正己烷相，取下層水相20ml用于分析。
（b）動物組織（魚、蝦）
┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入2ml去離子水，用渦旋儀渦動至糊狀，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩20min，3000g以上離心5min；
┅┅取上清液2.5ml至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；
┅┅加1ml正己烷用渦旋儀渦動20s溶解干燥殘留物，加入1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見配液1），用渦旋儀渦動1min，3000g以上離心10min；
┅┅除去上層正己烷相，取下層水相20ml用于分析。
（二）低檢測限樣本提取方法
動物組織（雞肉、雞肝、豬肉、豬肝）
┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
┅┅稱取2.0g±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入 10ml提取工作液，充分上下混合振蕩10min，再放入37℃恒溫箱，30min后取出，3000g以上，10℃離心10min；
┅┅取清亮上清20ml用于分析。
（三）血清前處理方法
┅┅將血樣本于室溫放置30min，3000g以上，10℃離心10min，分離出血清或過濾血清；
┅┅取1ml血清至10ml干凈的玻璃試管中，加入3ml 0.02 M 磷酸鹽緩沖液（見配液1）混合均勻；
┅┅取20ml用于分析。
（四）蜂蜜前處理方法
┅┅稱取1±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；
┅┅加入2ml 0.5 M鹽酸溶液（見配液2），用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；
┅┅放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30min；
┅┅加入5ml 0.2M氫氧化鈉（見配液3）（調(diào)pH值范圍為4～6）用振蕩器振蕩1min，再加入8ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩5min，3000g以上離心10min；
┅┅取上層液體至10ml干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干；
┅┅加1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見配液1）溶解；
┅┅取20ml用于分析
（五）尿液前處理方法
┅┅將尿液于3000g以上，室溫（20-25℃）離心5min，直至尿液樣本清亮；
┅┅移取1ml清亮尿液至10ml干凈的玻璃試管中，加入3ml提取工作液混合；
┅┅取20ml用于分析。
（六）牛奶前處理方法
┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；
┅┅移取1ml離心后的牛奶樣本至10ml干凈的玻璃試管中，加入0.02 M 磷酸鹽緩沖液（見配液1）按1︰19的體積比進行稀釋（即20ml牛奶+380ml 0.02磷酸鹽緩沖液）；
┅┅取20ml用于分析。
九、檢測步驟
測定前應須知：
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、加標準品/樣本：加入標準品/樣本20ml到對應的微孔中，然后加抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應30min。
6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見配液5）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
7、加酶標二抗：加酶標二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應20min，取出重復步驟6。
8、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應15min（見注意事項8）。
9、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。
十、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含磺胺類藥物的含量成負相關(guān)。
1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.211，樣本2的吸光度值為0.785，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.100；2ppb為1.680；4ppb為1.210；8ppb為0.580；16ppb為0.308；32ppb為0.120。則樣本1的濃度范圍是16ppb-32ppb再乘以其對應的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類藥物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是4ppb-8ppb再乘以其對應的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類藥物殘留的濃度范圍。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即
|
百分吸光度值（%）＝ |
B |
×100% |
|
B0 |
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以磺胺類藥物標準品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物的實際濃度
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索?。?/p>
樣本稀釋倍數(shù)
組織樣品稀釋倍數(shù)
高檢測限樣本：
（a）方法處理肌肉/肝臟和雞蛋樣品稀釋倍數(shù)：2
（b）方法處理魚、蝦樣品稀釋倍數(shù)：2
低檢測限樣本
肌肉/肝臟： 5
血清樣品稀釋倍數(shù)：4
蜂蜜樣品稀釋倍數(shù)：1
尿樣樣品稀釋倍數(shù)：4
奶樣樣品稀釋倍數(shù)：20
十一、檢測方法靈敏度、準確度、精密度
試劑盒靈敏度：2ppb
樣本最低檢測限：
血清樣本/尿樣檢測下限…………………………………8ppb
牛奶樣本檢測下限………………………………………40ppb
組織樣本檢測下限
高檢測限
肌肉/肝臟和雞蛋……………………………………… 4ppb
魚、蝦…………………………………………………… 4ppb
低檢測限
肌肉/肝臟………………………………………………10ppb
準確度：
雞肉/肝、豬肉/肝……………………………………75±10%
雞蛋…………………………………………………69±10%
蜂蜜、牛奶、血清……………………………………70±10%
精密度：
試劑盒的變異系數(shù)均小于10%
十二、注意事項
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件
保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封。標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質(zhì)的跡象
發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液A和底物液B液后，一般顯色20min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到25min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應時間。
9、該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
十三、貯藏條件及保存期
貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司
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