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中國(guó)食品網(wǎng)

卡那霉素(Kanamycin)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

   2009-03-04 中國(guó)食品網(wǎng)中食網(wǎng)1007

一、簡(jiǎn)介

本試劑盒是應(yīng)用ELISA研發(fā)的新一代藥物殘留檢測(cè)產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn),操作時(shí)間僅需55分鐘,能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。

二、試驗(yàn)原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中殘留的卡那霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗卡那霉素抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與殘留物卡那霉素的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中卡那霉素的含量。

三、適用范圍

可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織(肌肉、肝臟等)卡那霉素的殘留量。

四、交叉反應(yīng)率

卡那霉素…………………………………………………100%

鏈霉素……………………………………………………〈1%

雙氫鏈霉素………………………………………………〈1%

新霉素……………………………………………………… 〈1%

五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

設(shè)備:

┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm

┅┅均質(zhì)器

┅┅電熱恒溫水浴鍋

┅┅振蕩器

┅┅渦旋儀

┅┅離心機(jī)

┅┅天平:感量0.01g

┅┅刻度移液管:10ml

┅┅洗耳球

┅┅容量瓶:500ml

┅┅聚苯乙烯離心管:2ml、50ml

┅┅微量移液器:?jiǎn)蔚?20ml~200ml、200ml~1000ml

多道 250ml

試劑

 

----十二水合磷酸氫二鈉(分析純)

----氯化鈉(分析純)

----氫氧化鈉(分析純)

----二水合磷酸二氫鉀(分析純)

----氯化鉀(分析純)

----去離子水

六、提供的材料與試劑

1、 96孔酶標(biāo)板×1塊(包被有偶聯(lián)抗原)

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶:(1ml/瓶)

0ppb,0.5ppb,1.5ppb,4.5ppb,13.5ppb,40.5ppb

3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品:(1ml/瓶) 1ppm

4、酶標(biāo)二抗       7ml ……………………………… 紅色帽

5、抗體工作液     10ml ………………………………綠色帽

6、底物液 A液   7ml ………………………………白色帽

7、底物液 B液    7ml ………………………………紅色帽

8、終止液         7ml ……………………………… 黃色帽

9、 20×濃縮洗滌液 40ml …………………………… 透明帽

10、2×濃縮復(fù)溶液   50ml ………………………………藍(lán)色帽

七、溶液的配制

配液1: 0.1M PBS溶液(PH=10-11)

            稱取13.4g十二水合磷酸氫二鈉.20g氯化鈉.0.32g氫氧化鈉.0.5g二水合磷酸二氫鉀.0.5g氯化鉀加去離子水溶解定溶至500ml。

配液2: 洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1:19體積比進(jìn)行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌,洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

配液3: 復(fù)溶工作液

用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1:1體積比進(jìn)行稀釋(1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水),用于提取樣本的復(fù)溶,復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

八、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí),都必須注意:

(a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

(b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(c)未處理的樣本冷凍保存。

(d)處理好的樣本保存不可超過(guò)12h,應(yīng)及時(shí)用于分析檢測(cè)。

雞肉\豬肉、雞肝\豬肝樣本前處理方法

----稱取2.0±0.05g去除脂肪的粉碎樣本至50ml聚苯乙烯離心管中,加入6ml 0.1M PBS (PH=10~11)緩沖液(見(jiàn)配液1),混勻10min;

----放入60℃水浴環(huán)境中60min,取出水浴冷卻至室溫并搖勻;

----3000g以上,室溫離心10min;

----移取上清液,加入復(fù)溶工作液(見(jiàn)配液3),以1:4的體積比進(jìn)行稀釋(100ml上清液+400 ml復(fù)溶工作液);

----取50ml用于分析。

九、檢測(cè)步驟

測(cè)定前應(yīng)須知:

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20-25℃)。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

4、在所有恒溫孵育過(guò)程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。

操作步驟:

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20-25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數(shù)量的微孔板,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。

3、洗滌工作液在使用前也需回溫。

4、編號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本:加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml 到對(duì)應(yīng)的微孔中,加入酶標(biāo)二抗50ml/孔,再加入抗體工作液80ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)40min。

6、洗板:小心揭開(kāi)蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液(見(jiàn)配液2)250ml/孔,充分洗滌4-5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)。

7、顯色:加入底物液A液50ml/孔,再加底物液B液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中避光反應(yīng)15min(請(qǐng)參照注意事項(xiàng)8)。

8、測(cè)定:加入終止液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè),在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測(cè)定每孔OD值。(若無(wú)酶標(biāo)儀,則不加終止液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。

十、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含卡那霉素成負(fù)相關(guān)。

1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.512,樣本2的吸光度值為0.899,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb為1.950;0.5ppb為1.550;1.5ppb為1.200;4.5ppb為0.650;13.5ppb為0.301; 40.5ppb為0.110。則樣本1的濃度范圍是4.5ppb-13.5ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中卡那霉素殘留的濃度范圍;樣本2的濃度范圍是1.5ppb-4.5ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中卡那霉素殘留的濃度范圍。

2、定量分析

(1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即

百分吸光度值(%)=

B

×100%

B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中卡那霉素實(shí)際殘留量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來(lái)電索?。?/p>

樣本的稀釋倍數(shù):

肌肉、肝臟樣品的稀釋倍數(shù):20

十一、檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

試劑盒靈敏度:0.5ppb

樣本最低檢測(cè)限:

雞肉/肝,豬肉/肝…………………………………………… 10ppb

準(zhǔn)確度:

雞肉/肝,豬肉/肝………………………………………… 90±15%

精密度:

試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項(xiàng)

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(20-25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、每加一種試劑前需要將其搖勻。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。

5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒;也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

6、儲(chǔ)存條件

保存試劑盒于2-8℃,不要冷凍,將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。

7、試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。

8、在加入底物液A液和底物液B液后,一般顯色時(shí)間為10-15min即可。若顏色較淺,可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20min(或更長(zhǎng)),但不得超過(guò)30min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。

9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十三、貯藏條件及保存期

     貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。

保存期:該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。


    北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司
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