該成果以“A rapid method and mechanism to identify the active compounds in Malus micromalus Makino fruit with spectrum-effect relationship, components knock-out and molecular docking technology”為題發(fā)表于《Food and Chemical Toxicology》雜志上（即時(shí)IF:5.759，JCR TOP Q2區(qū)）
薔薇科蘋果屬植物西府海棠Malus micromalus Makino的果實(shí)化學(xué)成分種類豐富，主要包括黃酮類、有機(jī)酸類和揮發(fā)性成分等，藥理學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤、預(yù)防心腦血管老化、淡化肝斑、抗炎、抗氧化和抗衰老等功效。
圖 1 西府海棠果實(shí)
本研究以西府海棠果實(shí)對(duì)酪氨酸酶的活性影響，結(jié)合HPLC指紋圖譜構(gòu)建“譜-效模型”，通過譜-效關(guān)系篩選出活性物質(zhì)，并采用成分敲出法和UPLC-MS/MS法對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
Fig.2 HPLC fingerprints of M. micromalus fruit and its reference fingerprint （R）
Fig.3 Standardization regression coefficient of PLSA model of characteristics common peak-tyrosinase inhibition activity.
Fig.4 The high resolution mass spectra of Peak 2 knocked-out component.
Fig.5 The high resolution mass spectra of Peak 8 knocked-out component.
Fig.6 The MS/MS fragmentation pathway of p-Coumaric acid （a）、
4-O-β-Glucopyranosyl-cis-coumaric acid （c）。
在此基礎(chǔ)上，采用酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)探討敲出成分對(duì)酪氨酸酶催化反應(yīng)的影響及動(dòng)力學(xué)模型分析，并借助分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)活性成分和酪氨酸酶的結(jié)合模式，闡明西府海棠果實(shí)中對(duì)酪氨酸酶起抑制/激活作用的活性成分及其作用機(jī)制。
Fig. 7 Lineweaver-Burk plots of tyrosinase after the addition of p-coumaric acid （a），phloridzin （b），quercetin-3-O-α-rhamnoside （c） and 4-O-β-glucopyranosyl-cis-coumaric acid （d）。
Fig. 8 Molecular docking interaction of tyrosinase with p-coumaric acid（a）， phloridzin（b），quercetin-3-O-α-rhamnoside（c） and 4-O-β-glucopyranosyl-cis-coumaric acid（d）
Note: （a, b, c, d） Plane projection diagram of the interaction between compound and tyrosinase.
本研究通過譜-效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，在濃度0.5 g/mL時(shí)，西府海棠果實(shí)實(shí)對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用效果最好；PLS-DA分析顯示，西府海棠果實(shí)特征色譜中P2、P3、P5和P6對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用呈正相關(guān)（R＞0.1）；P8和P9對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用呈負(fù)相關(guān)（R＜-0.1）。通過UPLC-MS/MS法鑒定P2、P6、P8、P10、P11和12分別為對(duì)香豆酸、阿魏酸-酰基葡萄糖苷、香豆酸-4-O-葡萄糖苷、根皮素-2'-木糖葡萄糖苷、根皮苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。酪氨酸酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)香豆酸（P2）、根皮苷（P11） （P11＞0.50 mmol/L）對(duì)酪氨酸酶具有競爭性抑制作用，其中根皮苷濃度小于0.25 mmol/L時(shí)，具有混合性抑制作用。香豆酸-4-O-葡萄糖苷（P8）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（P12）分別在0~9 mmol/L、0.3-11 mmol/L的濃度范圍內(nèi)主要表現(xiàn)為非競爭性激活類型，而槲皮素-3-O-鼠李糖苷（P12）為混合型激活類型。酪氨酸酶分子對(duì)接結(jié)果表明：對(duì)香豆酸（P2）、香豆酸-4-O-葡萄糖苷（P8）、根皮苷（P11）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（P12）位于酶的疏水口袋活性中心，與酪氨酸酶殘基以氫鍵結(jié)合，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同維持復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
利用譜效關(guān)系，成分敲出及高分辨質(zhì)譜鑒定技術(shù)快速鑒定復(fù)雜中藥體系活性成分，闡述中藥整體觀，挖掘活性成分/成分群領(lǐng)域，本團(tuán)隊(duì)已形成了成熟的研究策略。研究成果先后發(fā)表在 Food and Chemical Toxicology （https://doi.org/10.1016/j.fct.2019.110754）；
Food Science and Human Wellness （https://doi.org/10.1016/j.fshw.2021.02.019）；
Food and Chemical Toxicology （https://doi.org/10.1016/j.fct.2019.110754）；
International Journal of Molecular Sciences （https://doi.org/10.3390/ijms19113439）；
Frontiers in pharmacology （https://doi.org/10.3389/fphar.2020.01342）等雜志。并以此技術(shù)創(chuàng)新集成，獲得2020年河南省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步二等獎(jiǎng)。
