近日，中國(guó)農(nóng)科院植保所作物病原生物功能基因組研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名期刊《植物生理學(xué)》（Plant Physiology）在線發(fā)表了題為“T-LOC: a comprehensive tool to localize and characterize the T-DNA integration sites”的論文，該研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)分析T-DNA插入位點(diǎn)分子特征的流程T-LOC。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化是植物基因工程的核心技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研和遺傳育種研究。T-DNA在植物基因組中的插入位點(diǎn)以及插入到基因組的T-DNA數(shù)目都是隨機(jī)的，且插入的T-DNA片段經(jīng)常會(huì)突破左右邊界的限制。此外，通過(guò)其它方法包括基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合、花粉管通道法轉(zhuǎn)化等產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的外源DNA片段的具有類(lèi)似的特性。轉(zhuǎn)基因植物的分子特征（T-DNA插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)、插入序列、以及對(duì)基因組造成的變化等）是轉(zhuǎn)基因植物安全評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容和核心，同時(shí)也是影響轉(zhuǎn)基因植物性狀的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)上，southern雜交、熒光定量實(shí)時(shí)PCR可以用來(lái)評(píng)估T-DNA的拷貝數(shù)，基于PCR的染色體步移技術(shù)（TAIL-PCR, Adapter-PCR）經(jīng)常被用來(lái)分離T-DNA的插入位點(diǎn)，但是上述方法只適用于T-DNA插入片段比較簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)基因植物，且操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)。
轉(zhuǎn)基因植物的高通量基因組測(cè)序數(shù)據(jù)已開(kāi)始被應(yīng)用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物的T-DNA插入片段的分子特征，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)TDNAscan，但是在多種T-DNA插入情況下，TDNAscan不能正確評(píng)估T-DNA插入位點(diǎn)，同時(shí)TDNAscan不能評(píng)估轉(zhuǎn)基因?qū)χ参锘蚪M造成的變化。該論文開(kāi)發(fā)了分析T-DNA插入位點(diǎn)的流程T-LOC （https://github.com/sfli001/T-LOC）。利用全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)、植物基因組序列和轉(zhuǎn)基因載體序列，T-LOC輸出轉(zhuǎn)基因組植物的所有T-DNA插入位點(diǎn)分子特征信息：包括T-DNA插入位點(diǎn)模式圖、T-DNA和植物基因組嵌合測(cè)序read序列、植物基因組插入位點(diǎn)測(cè)序reads分布圖、以及T-DNA插入位點(diǎn)上下游1kb植物基因組和載體序列。
利用48個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻植株的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，研究人員對(duì)T-LOC的性能進(jìn)行了全面的評(píng)估。T-LOC從48株水稻中分離到了75個(gè)完整的T-DNA插入位點(diǎn)（含左、右T-DNA插入位點(diǎn)），包括左右邊界定義的單個(gè)T-DNA、串聯(lián)或倒置重復(fù)的T-DNA、帶或者不帶抗性篩選標(biāo)記的截短T-DNA、攜帶T-DNA左右邊界之外的T-DNA骨架、多個(gè)完整和截短的T-DNA串聯(lián)體、T-DNA插入片段和轉(zhuǎn)基因植物之間的超短片段DNA等。研究人員還發(fā)現(xiàn)了T-DNA片段可以與農(nóng)桿菌的質(zhì)粒DNA片段融合后插入植物基因組。T-DNA插入植物基因組的同時(shí)，會(huì)引起植物基因組的變化，包括植物基因組的短片段缺失、基因組片段復(fù)制、植物基因組完美修復(fù)、和植物染色體重排，T-LOC可以提供轉(zhuǎn)基因植物基因組的變化。研究人員對(duì)這些研究結(jié)果通過(guò)PCR擴(kuò)增、sanger 測(cè)序和Nanopore長(zhǎng)read測(cè)序進(jìn)行了驗(yàn)證，進(jìn)一步證明了T-LOC是分析轉(zhuǎn)基因作物插入位點(diǎn)分子特征的有效工具。
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所李少芳博士和周煥斌博士為該論文的共同通訊作者，李少芳博士和本科實(shí)習(xí)生王晨陽(yáng)為共同第一作者。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所周雪平教授和復(fù)旦大學(xué)尤辰江博士也參與了該項(xiàng)研究。該研究得到中央公益性科研機(jī)構(gòu)基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目資等項(xiàng)目的資助。
